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如何使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗
點擊次數：1365 更新時間：2024-08-19
使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗是一個復雜但精確的過程，涉及多個關鍵步驟。以下是一個詳細的實驗流程，旨在指導如何正確使用該試劑盒進行RNA的檢測和定量分析。
一、實驗前準備
1.了解試劑盒信息：首先，仔細閱讀試劑盒的說明書，了解試劑盒的組成、儲存條件、有效期以及實驗所需的設備和試劑。
2.實驗設備和試劑準備：
-熒光定量PCR儀：確保儀器已經過校準，并熟悉其操作界面。
-微量移液器、離心機、渦旋振蕩器、分光光度計等實驗設備。
-無RNA酶的離心管、槍頭、EP管等耗材。
-試劑包括RNA提取試劑（如RNAiso Plus）、氯仿、異丙醇、75%乙醇（DEPC水配制）、反轉錄試劑、qPCR反應液等。
二、實驗步驟
1.細胞總RNA提取
1.細胞裂解：對于貼壁細胞，棄去培養液后，用PBS清洗一次，加入適量RNA提取試劑（如RNAiso Plus），吹打均勻后室溫靜置5分鐘。
2.兩相分離：加入適量的氯仿（如每1ml RNAiso Plus加入200μl氯仿），劇烈振蕩后室溫靜置5分鐘，然后4℃離心15分鐘（12000G）。此時，混合物將分為三層，RNA主要在水相上層。
3.RNA沉淀：小心吸取上層水相轉移至新的無RNA酶離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，再4℃離心10分鐘（12000G）。此時，RNA將在管底部形成膠狀沉淀。
4.RNA清洗：棄去上清，加入適量的75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕上下顛倒混勻，4℃離心5分鐘（7000rpm），重復清洗1-2次。
5.RNA干燥與溶解：小心吸去乙醇，室溫干燥RNA沉淀5-10分鐘，避免過分干燥。然后加入適量的無RNA酶水溶解RNA，保存于-80℃備用。
2.RNA濃度和純度測定
使用分光光度計測定RNA溶液在260nm和280nm處的吸光度值，計算RNA的濃度和純度（A260/A280比值應接近2.0）。
3.反轉錄合成cDNA
根據反轉錄試劑盒的說明書，將RNA反轉錄成cDNA。這通常涉及在RNA溶液中加入反轉錄酶、引物和其他必要組分，然后在適當的溫度下孵育一段時間。
4.qPCR實驗
1.配置qPCR反應液：按照試劑盒說明書，將qPCR反應液的各組分按比例混合，并加入適量的cDNA模板。
2.點板：將配置好的qPCR反應液加入96孔板或八聯管中，注意避免氣泡和液滴貼壁。
3.上機檢測：將加好樣的孔板或八聯管放入熒光定量PCR儀中，設置合適的反應條件（如溫度循環和熒光信號采集模式），開始實驗。
4.數據分析：實驗結束后，收集并分析熒光信號數據，根據標準曲線或CT值計算目標基因的相對表達量。
三、注意事項
1.避免污染：整個實驗過程中應嚴格遵循無RNA酶操作原則，防止RNA降解和污染。
2.精確操作：在加樣、離心等步驟中，應精確控制體積和時間，確保實驗結果的可重復性。
3.設備校準：定期對熒光定量PCR儀等實驗設備進行校準和維護，確保儀器的準確性和穩定性。
4.儲存條件：試劑盒和試劑應儲存在推薦的溫度下（通常為2-8℃或-20℃），避免光照和反復凍融。
使用熒光定量RT-PCR試劑盒進行實驗需要嚴格遵循實驗步驟和注意事項，以確保實驗結果的準確性和可靠性。
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